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細胞養得好,習性掌握牢


1不同的細胞喜歡的環(huán)境是不一樣的


這個(gè)不僅僅是說(shuō)培養基的不同,還有就是細胞生長(cháng)的空間密度問(wèn)題。有一些細胞是數量多一點(diǎn)比較好生長(cháng),生長(cháng)狀態(tài)也比較好。這種一般是屬于生長(cháng)速度慢的細胞。譬如內皮細胞。而有一些是細胞是數量少一點(diǎn)細胞狀態(tài)會(huì )生長(cháng)的比較好,譬如巨噬細胞和某些腫瘤細胞。尤其是巨噬細胞,生長(cháng)速度非常得快,貼壁速度很快,所以傳代時(shí)就應該留很少量的細胞,這樣細胞狀態(tài)會(huì )比較好。并且巨噬細胞比較喜歡扎堆生長(cháng),而堆與堆之間是有空間的。如果長(cháng)成相連在一起的一滿(mǎn)片的時(shí)候,細胞形態(tài)基本上就會(huì )差了,老化的會(huì )比較多,對后期實(shí)驗結果是不好的。所以在養細胞的時(shí)候應該摸索該細胞喜歡的生長(cháng)空間密度問(wèn)題。


2培養的細胞形態(tài)怎么養都不好


這個(gè)其實(shí)是有一個(gè)方法可以改善的。對于貼壁細胞,如果細胞形態(tài)不好,(或者細胞形態(tài)不清晰,表面似有異物等)可以在傳代的時(shí)候進(jìn)行如下操作:


首先,倒掉舊的培養基,加入3ml新的培養基(有無(wú)血清的都可)洗滌一次,用滴管吸走,然后再加入3ml的培養基,進(jìn)行預吹打,控制吹打力度,輕輕地大概沿著(zhù)瓶底過(guò)一遍,然后吸走。這時(shí)侯再開(kāi)始正式的消化、吹打。(巨噬細胞建議只吹打,不消化)


其次,把吹打下來(lái)的細胞懸液加入到新的培養瓶?jì)?,培養瓶事先加入培養基,放入培養箱內培養,按時(shí)間點(diǎn)觀(guān)察細胞貼壁情況。10分鐘觀(guān)察一次,20分鐘,30分鐘觀(guān)察一次。選擇一個(gè)時(shí)間點(diǎn),已經(jīng)有部分細胞貼壁的情況下,重新置于潔凈臺,底面朝上迅速倒出其中的培養基,加入3ml新培養基再輕輕洗一次。然后加入完全培養基培養。后續觀(guān)察細胞生長(cháng)情況以及形態(tài)。通常稱(chēng)之為“二傳”。


如果一次效果還不理想,可重復多次。直到找到細胞**形態(tài)。其中要注意,結合細胞喜歡的生長(cháng)情況。喜歡多一點(diǎn)數量長(cháng)得好的細胞你就等貼壁細胞比較多點(diǎn)的時(shí)候再傳。反之亦然。


3關(guān)于培養瓶?jì)燃?/span>入培養基量的問(wèn)題


這個(gè)是要靠自己去摸索的。并不是小的玻璃方瓶5ml,大方瓶10ml的。有些細胞反而是培養基少一點(diǎn)相反細胞形態(tài)會(huì )長(cháng)得比較好。(可能也是競爭很大,有優(yōu)勝劣汰吧)。對于生長(cháng)速度快的細胞,易生長(cháng)的細胞加少一點(diǎn)培養基細胞形態(tài)會(huì )更好。但是要注意換液的掌握。


4關(guān)于選擇培養瓶的問(wèn)題


個(gè)人發(fā)現生長(cháng)速度快的細胞在玻璃瓶?jì)壬L(cháng)的狀態(tài)會(huì )比一次性塑料瓶相對好一些。而對于同一種細胞,在其生長(cháng)旺盛快速的時(shí)期在玻璃瓶?jì)鹊纳L(cháng)狀態(tài)也比塑料瓶?jì)群?。這可能是因為塑料瓶比玻璃瓶更容易貼壁。生長(cháng)速度快的細胞在塑料瓶這種相對“更安逸”的環(huán)境里反而長(cháng)得狀態(tài)不如玻璃瓶好。


所以對于生長(cháng)速度慢的細胞如果想要更漂亮的細胞狀態(tài),塑料瓶比玻璃瓶會(huì )好,對于生長(cháng)速度快的細胞,玻璃瓶則會(huì )更好。同樣,對于同一種細胞,在其生長(cháng)速度慢的時(shí)候,塑料瓶會(huì )好一點(diǎn),比如剛剛復蘇的時(shí)候,或者原代培養的時(shí)候。而在其生長(cháng)旺盛的時(shí)候,玻璃瓶則相對會(huì )好一點(diǎn)。


5傳代時(shí)消化的問(wèn)題


可以這樣說(shuō),對于需要消化傳代的細胞,每一次的消化都是對這個(gè)細胞存活與否,狀態(tài)好與不好*至關(guān)重要的考驗。


很多同學(xué)都遇到過(guò)這個(gè)問(wèn)題,自己養的細胞開(kāi)始的幾代長(cháng)的還挺好的,可是穿過(guò)幾代之后就發(fā)現自己的細胞不行了,狀態(tài)越來(lái)越差勁了。對于這個(gè)問(wèn)題,可以非??隙ǖ卣f(shuō),你的消化環(huán)節出問(wèn)題了。你每一次的消化都讓細胞受到較大損傷了。所以,越長(cháng)越差。


在消化的過(guò)程中,你加入胰酶后,所有細胞都在被胰酶消化著(zhù),但是我們忽視了一個(gè)問(wèn)題就是,細胞的生長(cháng)狀態(tài)是不一樣的,每一個(gè)細胞的貼壁情況也是不一樣的,有的貼壁牢固,有的貼壁沒(méi)有那么牢固的,所以,讓所有的細胞消化同樣的時(shí)間對細胞是不公平的,他們受到了差別待遇當然會(huì )有脾氣啊。。。呵呵。大家爭取爭取做到因材施教,比如試試下面的“四步消化法”。以難消化細胞為例


具體操作

1).首先不加胰酶,倒掉舊培養基加入少量新培養基洗1-2遍目的是將漂浮著(zhù)的死細胞之類(lèi)盡量洗掉。


2).然后再加入少量新培養基直接吹打一遍,這一遍是把貼壁不牢固的細胞吹打下來(lái)。再用培養基洗一遍,兩次所得懸液混合傳入新瓶。(你可以將這些傳入新瓶培養,以與后面胰酶消化過(guò)的細胞對比觀(guān)察看誰(shuí)長(cháng)的更好一點(diǎn)就知道該細胞對胰酶的敏感度了。


3).吸干凈瓶?jì)仁S嘁后w,加入0.3ml左右的胰酶潤洗一遍,吸掉棄之,再加入1ml左右的胰酶消化。消化的同時(shí)置于顯微鏡下觀(guān)察,待細胞與細胞之間間隙明顯的時(shí)候立即吸掉胰酶與干凈子彈頭里備用,加入新培養基開(kāi)始吹打,吹打2-3遍后吸取懸液于試管或新瓶暫存。用2ml左右新培養基洗一遍與前面的混合。(也可以傳入新瓶培養,以與后面及前面的做對比。


4).然后把前面剛吸出來(lái)的胰酶重新加進(jìn)去瓶里繼續消化剩余的貼壁牢固的細胞。當然你也可以用新的胰酶,如果你們那比較富裕的話(huà),呵呵。繼續鏡下觀(guān)察,待剩余細胞間隙明顯,細胞獨立開(kāi)來(lái)的時(shí)候,吸掉胰酶,加入新培養基吹打。懸液傳入新瓶培養(根據實(shí)際情況把握)。


6關(guān)于換液傳代時(shí)候洗瓶的問(wèn)題


這個(gè)沒(méi)有經(jīng)過(guò)大規模驗證。對于用DMEM培養基培養的細胞,你在洗的時(shí)候如果是用無(wú)血清1640去洗細胞在隨即后的幾次中會(huì )比用DMEM洗的長(cháng)的要好。同樣,用1640培養的也有這個(gè)現象。


如果不嫌麻煩的話(huà),可以用PBS來(lái)洗,洗的效果和用無(wú)血清培養基洗的效果基本上是一樣的,對于有些細胞會(huì )更勝一籌。洗的目的主要是洗去培養瓶里殘留的血清,防止它對胰酶的影響。這樣能夠保證胰酶的消化能力優(yōu)先,是很關(guān)鍵的一點(diǎn)。

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