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細胞培養的成功因素之一細胞消化


1. 絕大部分細胞消化的時(shí)候是只要用胰酶潤洗一遍即可。去胰酶后,殘留的那些無(wú)法計算體積的附著(zhù)在細胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足夠消化細胞。對于這些細胞原則上不要用胰酶孵育細胞,連續這樣傳代,對細胞傷害很大。簡(jiǎn)單的程序是PBS潤洗吸去,胰酶潤洗吸去,然后37℃消化。比較難消化的細胞(潤洗方法5min還不能消化),這樣的細胞一般需要用少量胰酶孵育。


2.細胞如何
算是消化好了呢?不是細胞全部成間隔分布很離散的單個(gè)圓形才算消化好了,一般你肉眼觀(guān)察貼壁細胞層,只要能移動(dòng)了,多半呈沙壯移動(dòng),其實(shí)已經(jīng)可以了,很多人喜歡把細胞消化或者吹打成完全分離細胞,這是沒(méi)有必要的。一般能移動(dòng)了,說(shuō)明細胞與培養基質(zhì)材料的附著(zhù)已經(jīng)消失了,細胞之間的附著(zhù)也已經(jīng)消失了,細胞已經(jīng)獨立分布了(雖然沒(méi)有呈現很廣的離散分布)。這個(gè)時(shí)候應該停止消化,不要等到看到鏡下所有細胞都分離得非常好,間隙很大,才停止。細胞就是完全成單個(gè)細胞懸液,之后在貼壁的過(guò)程中仍然會(huì )聚集,這個(gè)是貼壁培養的細胞,尤其是腫瘤細胞的一個(gè)特性。如果和標準形態(tài)不一致,那可能是自己沒(méi)消化好導致的,但如果消化方法正確,仍然成片分布,甚至完全吹打成單細胞懸液,貼壁后仍然成片分布,這是細胞的特性,是因為貼壁過(guò)程中重新聚集了。這個(gè)時(shí)候你拼了命要去讓它均勻分布,你的細胞之后會(huì )對你越來(lái)越不好。


3.EDTA的作用。胰酶切割ECM的一些負責粘連和附著(zhù)的蛋白,而EDTA通過(guò)螯合Ca離子,作用于Integrin的活性,所以EDTA的作用更加溫和。有的人在胰酶里添加一些EDTA,或者對付特別難消化的細胞,添加多一些EDTA。

4.PBS
洗滌。消化之前用PBS洗滌,是常見(jiàn)的操作,因為血清中含有抑制胰酶的蛋白。對于一些難消化細胞,那么可以配制不含Ca,Mg離子的PBS,因為這些離子也會(huì )抑制胰酶的活性。但對于絕大部分胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化的細胞,不需要配制如此溶液。

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